Etelämantereelta viidakkoon kulkeva erikoisjuna saattaa lakata olemasta, ja syynä on rautateiden huononeminen. Eläimet, jotka pelkäsivät menettävänsä ainoan matkustamisen mahdollistavan kuljetusvälineen, kääntyivät Diegon puoleen saadakseen apua Go Diego Go! Diego's Railroad Rescue. Poika on valmis auttamaan ja ottaa sinut mukaan suunnitelmansa toteuttamiseen. Se sisältää tien korjaamisen, mutta ensin sinun on laitettava kaikki eläimet vaunuihin. Matkustajat suostuvat matkustamaan vain omanlaisensa seurassa, joten pingviineille, peuroille, karhuille ja niin edelleen on erillinen vaunu. Kun kaikki eläimet on sijoitettu, juna aloittaa matkansa ja ennen jokaista pysähdystä tie on koottava palapelin tavoin kääntämällä yksittäisiä osia Go Diego Go! Diego's Railroad Rescue.
